Laporan Kuljar

ACARA I

STERILISASI PERALATAN

I.     PENDAHULUAN

A.       Latar Belakang

Kultur jaringan meliputi penanaman sel atau agregat sel, jaringan, dan organ tanaman pada medium yang mengandung gula, vitamin, asam-asam amino, garam-garam anorganik, air, zat pengatur tumbuh, dan bahan pemadat. Komposisi medium tumbuh ternyata sangat menguntungkan pula bagi pertumbuhan cendawan dan bakteri. Bila diberi kesepatan maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dengan cepat dan dalam waktu singkat akan menutupi permukaan medium serta eksplan yang ditanam. Selanjutnya mikroorganisme tersebut akan menyerang eksplan melalui luka-luka akibat pemotongan dan penanganan pada saat sterilisasi sehingga mengakibatkan kematian eksplan.

Untuk menghilangkan sumber infeksi, bahan tanaman harus disterilkan sebelum ditanamkan pada medium tumbuh. Jaringan ataupun organ yang terinfeksi jamur atau bakteri sistemik hendaknya dibuang.

Bahan-bahan sterilisasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman sudah banyak tersedia. Larutan hipoklorit (natrium ataupun kalsium) telah terbukti efektif pada kebanyakan bahan tanaman. Bahan sterilisasi pun bersifat meracuni jaringan. Oleh karena itu, tingkat konsentrasi dan lamanya perlakuan harus benar-benar diperhatikan untuk mengurangi resiko kematian jaringan.

Pada umumnya, jika eksplan yang digunakan agak keras dan cukup besar maka dapat segera disterilisasi dengan disinfektan. Pada kultur biji atau endosperm dewasa tanaman Euphorbiaceae, sterilisasi dilakukan terhadap seluruh biji atau biji-biji yang dikupas. Bila ovul, embrio, atau endosperm muda yang akan dikulturkan maka metode yang dipakai adalah mensterilkan ovari ataupun ovul dan mengambil eksplan dibawah kondisi aseptik sehingga jaringan inokulum yang lunak terlindungi dari pengaruh bahan sterilisasi yang bersifat racun. Sama halnya dengan kultur antera, tunas bunga disterilkan dan eksplan antera diisolasi sacara aseptik. Eksplan tersebut biasanya bebas dari kontaminasi jasad renik.

B.       Tujuan

Meningkatkan keterampilan mahasiswa dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan menggunakan outoclave.

II.           TINJAUAN PUSTAKA

Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat gelas dan logam dapat disterilkan dalam Autoclave. Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bactinerator khusus untuk scalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Esha, 2010).

Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah : pinset, scalpel, petridish, gunting, kertas saring, dan botol-botol kosong.

Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan media kultur jaringan, alat alat yang berupa glass ware atau dissecting kit sebelum digunakan harus disterlikan terlebih dahulu. demikian juga dengan media kultur jaringan yang sudah di masukan kedalam botol media harus di sterlikan dahulu sebelum di gunakan (Anonim, 2010).

Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka medium dan alat-alat yang diperlukan harus disterilisasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu suatu proses untuk mematikan semua organisme yang dapat menjadi kontaminan. Metode yang lazim digunakan untuk mensterilisasikan media dan alat-alat ialah dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan autaklaf), sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering (menggunakan oven) (Ermila, 2010).

Beberapa sumber kontaminasi mikroorganisme pada sistem kultur jaringan dapat dikemukakan sebagai berikut :

1.      Medium sebagai akibat proses sterilisasi yang tidak sempurna

2.      Lingkungan kerja dan pelaksanaan yang kurang hati-hati dan kurang teliti

3.      Eksplan

a.       Secara internal (kontaminan terbawa di dalam jaringan)

b.      Secara eksternal (kontaminan berada di permukaan eksplan) akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna

4.      Dari serangga atau hewan kecil yang berhasil masuk ke dalam botol kultur setelah diletakkan di dalam ruang kultur ataupun ruang stok

Dari semua sumber kontaminasi, yang paling sulit diatasi adalah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, dalam memilih suatu metode sterilisasi harus selektif, kita hanya mengeliminasi jamur atau bakteri yang tidak diinginkan dengan gangguan seminimal mungkin terhadap bahan eksplan (Zulkarnain, 2009).

Alat-alat dissecting-set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilisasi di dalam autoclave dengan suhu 120^oC, tekanan 17,5 psi dan lama sterilisasi kurang lebih 15-20 menit (Hendaryono, 1994).

Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan alumunium foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi alat-alat, yakni 15 menit, tetapi suhu dan tekanannya sama (Hendaryono, 1994).

Cara menghilangkan sumber infeksi, bahan tanaman harus disterilkan sebelum ditanam pada medium tumbuh. Jaringan ataupun organ yang terinfeksi jamur atau bakteri sistemik hendaknya dibuang. Penggunaan merkuri klorida (HgCl₂) terbukti efektif untuk sterilisasi bahan tanaman yang berasal dari lapangan (Zulkarnain, 2009).

III.        PELAKSANAAN PRAKTIKUM

A.      BAHAN DAN ALAT

Bahan dan alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah :

1.      Bahan :

a.       Eksplan (biji jeruk)

b.      Alkohol

c.       Agar-agar

2.      Alat :

a.       Glass ware : botol kultur, erlenmayer, petridish

b.      Dissecting kit : scalpel, pinset

c.       Autoclave

d.      Alumunium foil

e.       Keret gelang

f.       Kompor

g.      Kertas payung/pembungkus

B.       PROSEDUR KERJA

1.      Glass ware dan Dissecting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu dikeringkan. Setelah kering mulut botol ditutup dengan alumunium foil, untuk pinset dan scalpel dibungkus dengan kertas payung

2.      Glass ware dan Dissecting kit disterilkan dengan autoclave pada suhu 120⁰ C pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit

3.      Selama sterilisasi autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, selanjutnya katub dibuka untuk membuang uap air sehingga tekanan akan turun hingga ke tekanan 0 psi dan dilakukan sampai tiga kali

4.      Autoclave dibuka dan peralatan yang sudah disterilisasi dikeluarkan

5.      Peralatan disimpan ditempat yang bersih

IV.        HASIL DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil Pengamatan

NO	GAMBAR	KETERANGAN
1		Nama Alat : Autoclave Kegunaan => Penyeteril alat-alat Jenis Alat : -
2		Nama Alat : Kompor gas Kegunaan => Sebagai pemanas Autoclave Jenis Alat : -
3		Nama Alat : Botol Kultur Kegunaan => untuk meletakkan eksplan sebagai media Jenis Alat : Glass ware
4		Nama Alat : Api Bunsen Kegunaan => untuk memflamir mulut botol, membakar pinset, dan scalpel Jenis Alat : Glass ware
5		Nama Alat : Timbangan Digital Kegunaan => untuk menimbang Jenis Alat : -
6		Nama Alat : Petridish Kegunaan => tempat menaruh eksplan Jenis Alat : Glass ware
7		Nama Alat : Pinset Kegunaan => Mengambil eksplan Jenis Alat : Dissecting kit
8		Nama Alat : Scalpel Kegunaan => untuk memotong eksplan Jenis Alat : Dissecting kit
9		Nama Alat : Pipet Kegunaan => untuk memberikan cairan pada eksplan Jenis Alat : Glass ware
10		Nama Alat : Erlenmeyer Kegunaan => Menakar pembuatan stok Jenis Alat : Glass ware
11		Nama Alat : Beker glass Kegunaan => untuk mengukur volume stok Jenis Alat : Glass ware
12		Nama Alat : Gelas Ukur Kegunaan => untuk menakar cairan stok yang dibutuhkan Jenis Alat : Glass ware
13		Nama Alat : Pengaduk Kaca Kegunaan => untuk mengaduk Jenis Alat : Glass ware
14		Nama Alat : pengaduk Kayu Kegunaan => untuk mengaduk Jenis Alat : -
15		Nama Alat : Hand Sprayer Kegunaan => Menyemprot Eksplan Jenis Alat : -
16		Nama Alat : Alumunium Foil Kegunaan => untuk menutup mulut botol Jenis Alat : -
17		Nama Alat : Korek Api Kegunaan => Memberi api dalam pembakaran Jenis Alat : -
18		Nama Alat : Tisu Kegunaan => untuk membersihkan alat Jenis Alat : -
19		Nama Alat : Corong Kegunaan => Menuangkan media dalam botol kultur Jenis Alat : -
20		Nama Alat : Glove Kegunaan => agar tangan steril & menjaga dari bahan kimia Jenis Alat : -
21		Nama Alat : Karet Gelang Kegunaan => untuk mengikat, & untuk sterilisasi pinset Jenis Alat : -

B.     Pembahasan

Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat biotek seperti tip, e-tube, mortar pestle, dan lain-lain. Selain itu alat ini juga digunakan untuk mensterilkan media, baik media agar atau pun media cair. Juga dapat digunakan untuk sterilisasi tanah atau kompos yang akan digunakan untuk media tanaman. Prinsip kerja Autoclave sama dengan prinsip kerja kukusan (alat sederhana untuk menanak nasi) hanya saja memiliki tekanan sehingga menghasilkan panas yang lebih tinggi. Hal ini bertujuan untuk lebih menyempurnakan proses sterilisasi. Tahap sterilisasi sebenarnya cukup singkat yaitu dengan suhu 120⁰C selama 20 menit, dengan tekanan 15-17,5 psi. Namun waktu keseluruhan mulai dari pemanasan awal (kenaikan suhu) sampai pendinginan (penurunan suhu) bisa mencapai kurang lebih 2 jam-an. Yang perlu diperhatikan selama mengoperasikan alat ini adalah: tulis siapa pengguna (nama, waktu dan lab.) sebelum start, selalu memakai sarung tangan tahan panas, isilah air sesuai ukuran yang ditentukan sebelum start, jangan membuka autoclave sebelum suhu dingin (dibawah 60⁰C).

Sebelum melakukan praktikum kultur jaringan, alat-alat yang akan dipakai dalam kultur jaringan harus steril terlebih dahulu. Pertama botol kultur yang akan digunakan untuk menaruh eksplan direndam dengan detergen selama 24jam untuk mematikan bakteri yang ada di botol tersebut. Setelah itu botol ditiriskan agar air yang ada di botol tidak ada. Kemudian botol di beri alumunium foil dengan sil sebagai perekat alumunium foil agar kencang di mulut botol kultur tersebut, sebelum dimasukkan kedalam autoclave. Taruh botol kultur yang telah diberi alumunium ke dalam autoclave, selama 20 menit dengan tekanan 17,5 psi (dilakukan pengulangan sampai 3x). Setelah selesai keluarkan botol kultur dari dalam autoclave, dinginkan atau biarkan selama kurang lebih 2 hari. Botol kultur tersebut di taruh di ruang inkubasi. Penyetrilan media yang akan di gunakan kultur jaringan di lakukan pada tanggal 23 November 2010. Botol kultur yang telah didinginkan dilakukan penyeterilan lagi didalam autoclave selama 20 menit dengan tekanan 17,5 psi. Kemudian keluarkan botol kultur tersebut dan isi agar-agar sebagai dasar media untuk meletakkan eksplan. Tutup dengan alumunium dengan sil, dan masukkan kedalam autoclave lagi selama 20 menit dengan tekanan yang sama 17,5 psi. Setelah selesai botol kultur ditaruh didalam ruang inkubasi untuk menghindari botol kultur yang sudah steril tersebut dari kontaminasi. Penyiapan media ini dilakukan pada tanggal 27 November 2010.

Alat-alat yang harus disterilkan dalam praktikum kultur jaringan adalah alat-alat yang akan dipakai dalam membuat kultur jaringan. Seperti botol kultur sebagai tempat eksplan tumbuh, scalpel, pinset, petridish, dan alat-alat yang lain sebagai pendukung dalam proses kultur jaringan.

Alat-alat yang digunakan dalam proses kultur jaringan antara lain :

A.    Alumunium foil     =>        digunakan untuk menutup mulut botol kultur

B.     Api Bunsen           =>        digunakan untuk memflamir alumunium foil dan mulut botol kultur

C.     Autoclave              =>        digunakan untuk penyeteril alat-alat yang akan digunakan dalam kultur jaringan

D.    Botol kultur           =>        digunakan untuk menaruh eksplan

E.     Corong                  =>        digunakan untuk menuangkan agar-agar dalam botol kultur

F.      Erlenmeyer            =>        digunakan untuk mengukur volume cairan

G.    Gelas beker           =>        digunakan untuk mengukur volume cairan stok yang dibutuhkan

H.    Gelas ukur kaca     =>        digunakan untuk menakar cairan stok yang dibutuhkan

I.       Glove                    =>        digunakan untuk menjaga agar tangan steril dan menjaga dari bahan kimia

J.       Karet                     =>        digunakan untuk mengikat dan sterilisasi pinset

K.    Kompor                 =>        digunakan untuk memanasi autoclave

L.     Korek api              =>        digunakan untuk memberi api dalam pembakaran

M.   Pengaduk kaca      =>        digunakan untuk mengaduk cairan

N.    Pengaduk kayu     =>        digunakan untuk mengaduk

O.    Petridish                =>        digunakan untuk tempat menaruh eksplan, dan sebagai tempat landasan untuk mengiris eksplan

P.      Pinset                    =>        digunakan untuk mengambil dan menjepit eksplan

Q.    Pipet                      =>        digunakan untuk memberikan cairan pada eksplan

R.     Scalpel                   =>        digunakan untuk mengiris eksplan

S.      Sprayer                  =>        digunakan untuk menyemprot eksplan

T.      Timbangan digital =>        digunakan untuk menimbang

U.    Tisue                      =>        digunakan untuk membersihkan alat

V.           SIMPULAN DAN SARAN

A.      Simpulan

Sebelum melakukan praktikum kultur jaringan, sebaiknya dilakukan pengenalan alat-alat yang akan digunakan di dalam proses kultur jaringan untuk mempermudah ketika proses dilakukan. Setelah dilakukan pengenalan alat-alat apa saja yang akan digunakan di dalam kultur jaringan, perlu adanya penyeterilan alat-alat. Alat-alat yang harus dilakukan sterilisasi terlebih dahulu antara lain botol kultur, scalpel, dan pinset karena alat-alat inilah yang berperan besar dalam pengkulturan eksplan. Botol kultur sebagai media yang digunakan untuk meletakkan eksplan, scalpel dan pinset alat yang akan digunakan untuk mengiris eksplan dan menjepit eksplan. Penyeterilan tersebut harus dilakukan untuk menjaga alat-alat yang akan digunakan steril dan tidak ada kontaminan di alat tersebut.

B.     Saran

Saat melakukan sterilisasi menggunakan autoclave harus hati-hati dan dijaga terus agar suhu tetap pada suhu 120^oC, dan pada tekanan 17,5 psi. Jika tidak dijaga dikhawatirkan suhu dan tekanan meningkat dan akan mengakibatkan ledakan.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2010. Kultur Jaringan. http://biotektanaman.wordpress.com. Diakses tanggal 12 Desember 2010.

Ermila, M. 2010. Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi. http://Milaermila.blogspot.com. Diakses tanggal 24 Desember 2010.

Esha. 2010. Cara Sterilisasi Alat-Alat dan Media. http://eshaflora.blogspot.com. Diakses pada tanggal 24 Desember 2010.

Hendaryono, S dan Ari Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.

Wetter, L.R dan F. Constabel. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. ITB Bandung. Bandung.

Widarto, L. 1996. Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek, Cangkok, Sambung, Okulasi, dan Kultur Jaringan. Kanisius. Jakarta.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara. Jakarta.

ACARA II

PEMBUATAN MEDIA

I.     PENDAHULUAN

A.           Latar Belakang

Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur In vitro yang optimal bervariasi antar spesies ataupun antar varietas. Bahkan, jaringan yang berasal dari bagian tanaman yang berbeda pun akan berbeda kebutuhan nutrisinya. Oleh karena itu, tidak ada satu pun medium dasar yang berlaku universal untuk semua jenis jaringan dan organ. Meskipun demikian, medium dasar MS yang direvisi adalah yang paling luas penggunaannya dibandingkan dengan media dasar lainnya.

Media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam. Media tersebut harus berisi garam mineral berupa unsur hara mikro dan makro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuh.

Zat pengatur tumbuh (ZPT) sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan differensiasi. Tanpa penambahan ZPT dalam medium pertumbuhan mungkin terhambat bahkan tidak tumbuh. Golongan auksin yang sering ditambahkan pada medium kultur jaringan tanaman adalah 2,4-D, IAA, NAA, dan IBA. Dari golongan sitokinin adalah kinetin, zeatin, dan BAP.

Sumber karbon dan energi yang biasanya dipakai dalam kultur jaringan adalah sukrosa. Jenis gula lain seperti glukosa, dan fruktosa juga dapat digunakan. Kadar sukrosa biasanya berkisar antara 2-4%.

Medium kultur jaringan dapat berupa medium cair dan medium padat. Pada medium padat bahan pemadat yang banyak digunakan adalah agar-agar. Penggunaan agar biasanya adalah 8-10 gram per liter.

B.            Tujuan

Tujuan dilakukannya praktikum kultur jaringan tanaman acara pembuatan media adalah sebagai berikut :

1.      Mengetahui dan mempraktikan cara membuat larutan stok

2.      Mengetahui dan mempraktikan cara membuat media MS

3.      Melakukan sterilisasi medium

II. TINJAUAN PUSTAKA

Merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf pada suhu 120º C selama 15 menit (Pandhit, 2010).

Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 – 5 mgL-1. Untuk multiplikasi tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA pada konsentrasi yang rendah. Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 1 – 2 mgL-1 ditambahkan. Faktor yang paling sulit ditentukan dalam kultur jaringan adalah zat pengatur tumbuh dan biasanya perlu melakukan penelitian kecil untuk menentukan konsentrasi terbaik yang akan digunakan. Ada 2 pendekatan: Pendekatan pertaman adalah dengan menggunakan media dasar MS dan meneliti kisaran dua zat pengatur tumbuh yang berbeda (Anonim, 2010).

Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel. Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7 – 1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin kadang – kadang digunakan pada lab komersial. Gel sintetis diketahui dapat menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental untuk 1 L media (Anonim, 2010).

Keasaman medium adalah salah satu yang mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan tanaman. Pada umumnya, keasaman medium ditetapkan antara 5,6-5,8. Medium yang terlalu masam (pH <4,5) atau terlalu basa (pH >7,0) dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Hal itu mungkin disebabkan oleh tidak tersedianya sejumlah unsur hara pada kisaran pH tertentu. Pada pH tinggi, unsur-unsur seperti besi, seng, mangan, tembaga, dan boron mengalami presipitasi sebagai hidroksida sehingga tidak tersedia bagi jaringan yang dikulturkan. Sedangkan pada pH rendah, unsur-unsur seperti kalsium, magnesium, belerang, fosfor, dan molibdat menjadi tidak tersedia. Medium dengan pH rendah seringkali digunakan dalam seleksi untuk mendapatkan tanaman yang toleran terhadap keasaman tinggi (Zulkarnain, 2009).

Jennis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalkan, medium Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek, tetapi tidak cocok untuk media tumbuhan tanaman yang lain. Untuk menanam eksplan dari tanaman keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Knudson C hanya cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek (Hendaryono, 1994).

III. PELAKSANAAN PRAKTIKUM

A.      BAHAN DAN ALAT

Bahan dan alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah :

1.      Bahan

Media MS :

a.       Unsur hara makro

a.)    KNO₃                          : 1.900 mg/l

b.)    NH₄NO₃                     : 1.650 mg/l

c.)    CaCl₂.2H₂O          : 440 mg/l

d.)   MgSO₄.7H₂O        : 370 mg/l

e.)    KH₂PO₄                      : 170 mg/l

b.      Unsur hara mikro

a.)    MnSO₄.4H₂O        : 22,3 mg/l

b.)    ZnSO₄.7H₂O         : 8,6 mg/l

c.)    M₃BO₄                        : 6,2 mg/l

d.)   KI                          : 0,83 mg/l

e.)    Na₂MoO₄.2H₂O    : 0,25 mg/l

f.)     CuSO₄.5H₂O         : 0,025 mg/l

c.       Besi

a.)    FeSO₄.7H₂O         : 27,8 mg/l

b.)    Na₂-EDTA.2H₂O  : 37,3 mg/l

d.      Vitamin

a.)    Mio Inositol          : 100 mg/l

b.)    Thiamin HCl         : 0,1 mg/l

c.)    Asam nikotinat      : 0,5 mg/l

d.)   Piridoksin HCl      : 0,5 mg/l

e.)    Glisin                     : 2 mg/l

e.       ZPT

a.)    Sitokinin    : 1 mg/l

b.)    Auksin       : 1 mg/l

f.       Bahan pemadat (agar) : 7 g/l

g.      Sukrosa                       : 30 g/l

h.      KOH atau NaOH        : 1M

i.        HCl                             : 1M

2.      Alat

a.       Tabung Erlenmayer

b.      Gelas ukur

c.       Pipet

d.      Pengaduk

e.       Kompor

f.       pH meter

g.      Timbangan

h.      Botol kultur

i.        Magnetik strirer

j.        Autoclave

k.      Alumunium foil

l.        Karet

m.    Kertas payung

B.       PROSEDUR KERJA

1.      Pembuatan Larutan Stok

a.       Larutan stok A merupakan larutan hara makro dibuat 10 kali dilarutkan dalam 1000 ml aquades

b.      Larutan stok B, merupakan larutan hara mikro dibuat 1000 kali dilarutkan dalam 100 ml aquades

c.       Larutan stok C, merupakan campuran FeSO₄.7H₂O dan Na-EDTA dibuat 100 kalu dan dilarutkan ke dalam 200 ml aquades

d.      Larutan stok D, merupakan larutan vitamin kecuali Mio Inositol dibuat 100 kali dalam 200 ml aquades

e.       Larutan stok E, merupakan larutan Mio Inositol dibuat 100 kali dalam 100 ml aquades

f.       Larutan stok F, merupakan larutan ZPT dibuat 100 kali dalam 500 ml aquades

2.      Pembuatan Medium Kultur

a.       Aquades sebanyak 500 ml dipersiapkan di dalam erlenmeyer ukuran 1000 ml. Larutan stok A,B,C,D,E, dan F dimasukkan kedalam erlenmeyer sesuai yang dibutuhkan. Untuk pembuatan 1 liter medium, maka stok A diambil sebanyak 100 ml, stok B 0,1 ml, stok C 2 ml, stok D 2 ml, stok E 1 ml, dan stok F 5 ml. Semua dicampur sambil digoyangkan wadahnya agar semua bahan kimia tersebut tercampur

b.      Sukrosa ditimbang sebanyak 30 gram dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer sambil diaduk sampai homogen

c.       Aquades ditambahkan sampai volumenya 1000 ml

d.      pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter elektrik atau kertas lakmus, pH yang dibutuhkan sekitar 5,7-5,8. Jika terlalu asam ke dalam larutan ditambahkan KOH atau NaOH 1M dan jika terlalu basa dapat ditambahkan HCl 1M. Penambahan bahan tersebut dilakukan hingga pH yang diinginkan tercapai

e.       Agar-agar ditambahkan ke dalam larutan tersebut sebanyak 7 gram, lalu dipanaskan diatas kkompor sampai mendidih sambil di aduk-aduk

f.       Medium dituangkan ke dalam botol kultur sekitar 20 ml per botol tergantung ukuran botol

g.      Botol ditutup dengan alumunium foil

3.      Sterilisasi Media

a.       Botol kultur yang sudah berisi dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilkan dengan tekanan 15-17,5 psi pada suhu 120⁰ C selama 20 menit sampai tiga kali

b.      Setelah disterilkan, botol-botol yang berisi medium diangkat dan disimpan dalam ruang yang sejuk sampai siap digunakan

c.       Medium siap digunakan, namun untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi dalam medium sebaiknya dibiarkan selama beberapa hari

IV.   HASIL DAN PEMBAHASAN

A.      Hasil Perhitungan

a.       Unsur Hara Makro (Stok A)

v  KNO₃ 1900 mg/l

KNO₃                    = 1900 mg/l x 5 kali

                              = 9500 mg

                              = 9,5 gram

v  NH₄NO₃ 1650 mg/l

NH₄NO₃                = 1650 mg/l x 5 kali

                              = 8250 mg

                              =8,25 gram

v  CaCl₂.2H₂O 440 mg/l

CaCl₂.2H₂O          = 440 mg/l x 5 kali

                              = 2200 mg

                              = 2,2 gram

v  MgSO₄.7H₂O 370 mg/l

MgSO₄.7H₂O        = 370 mg/l x 5 kali

                              = 1850 mg

                              = 1,85 gram

v  KH₂PO₄ 170 mg/l

KH₂PO₄                = 170 mg/l x 5 kali

                              = 850 mg

                              = 0,85 gram

Volume Stok A     =

                              = 19.000 mg/l

ð    =

= 0,1 L

= 100 ml

b.      Unsur Hara Mikro (Stok B)

v  MnSO₄ 22,3 mg/l

MnSO₄                  = 22,3 mg/l x 100 kali

                              = 2230 mg

                              = 2,23 gram

v  ZnSO₄.7H₂O 8,6 mg/l

ZnSO₄.7H₂O         = 8,6 mg/l x 100 kali

                              = 860 mg

                              = 0,86 gram

v  Mn₃BO₃ 6,2 mg/l

Mn₃BO₃                      = 6,2 mg/l x 100 kali

                              = 620 mg

                              = 0,62 gram

v  KI 0,83 mg/l

KI                          = 0,83 mg/l x 100 kali

                              = 83 mg

                              = 0,083 gram

v  Na₂MoO₄.2H₂O 0,25 mg/l

Na₂MoO₄.2H₂O    = 0,25 mg/l x 100 kali

                              = 25 mg

                              = 0,025 gram

v  CuSO₄.5H₂O 0,025 mg/l

CuSO₄.5H₂O         = 0,025 mg/l x 100 kali

                              = 2,5 mg

                              = 0,0025 gram

Volume Stok B     =

                              = 4460 mg/l

ð       =

= 0,005 L

= 5 ml

c.       Besi (Stok C)

v  FeSO₄.7H₂O 27,8 mg/l

FeSO₄.7H₂O         = 27,8 mg/l x 10 kali

                              = 278 mg

                              = 0,278gram

v  Na₂-EDTA.2H₂O 37,3 mg/l

Na₂-EDTA.2H₂O  = 37,3 mg/l x 10 kali

                              = 373 mg

                              = 0,373 gram

Volume Stok C     =

                              = 556 mg/l

ð       =

= 0,05 L

= 50 ml

d.      Vitamin (Stok D dan Stok E)

v  Mio Inositol 100 mg/l

Mio Inositol          = 100 mg/l x 10 kali

                              = 1000 mg

                              = 1 gram

v  Thiamin HCl 0,1 mg/l

Thiamin HCl         = 0,1 mg/l x 10 kali

                              = 1 mg

                              = 0,001 gram

v  Asam Nikotinat 0,5 mg/l

Asam Nikotinat     = 0,5 mg/l x 10 kali

                              = 5 mg

                              = 0,005 gram

v  Piridoksin HCl 0,5 mg/l

Piridoksin HCl      = 0,5 mg/l x 10 kali

                              = 5 mg

                              = 0,005 gram

v  Glisin 2 mg/l

Glisin                     = 2 mg/l x 10 kali

                              = 20  mg

                              = 0,020 gram

Volume Stok D atau Stok E     =

                    = 2000 mg/l

ð             =

= 0,05 L

= 50 ml

e.       ZPT (Stok F)

v  Sitokinin 1 mg/l

Sitokinin                = 1 mg/l x 100 kali

                              = 100 mg

                              = 0,1 gram

v  Auksin 1 mg/l

Auksin                   = 1 mg/l x 100 kali

                              = 100 mg

                              = 0,1 gram

Volume Stok F     =

                              = 200 mg/l

ð     =

 = 0,005 L

 = 5 ml

B.     Pembahasan

Alat dan bahan yang digunakan dalam pembuatan media antara lain botol kultur, autoclave, alumunium foil, dan agar-agar.

Semua bahan dan alat yang dibutuhkan dalam pembuatan media disiapkan. Hal yang pertama kali dilakukan botol kultur di masukkan ke dalam autoclave dengan suhu 120^oC, dan pada tekanan 17,5 psi selama 15 menit. Setelah itu botol kultur di keluarkan dari autoclave untuk di isi agar-agar sebagai media dasar ketika menanam eksplan. Apabila botol kultur telah di isi agar-agar, botol kultur kembali di masukkan ke dalam autoclave untuk melakukan penyeterilan kembali. Pada suhu dan tekanan yang sama, yaitu suhu 120^oC, dan pada tekanan 17,5 psi selama 15 menit ini dilakukan 3 kali pengulangan agar media benar-benar steril tidak terdapat kontaminan. Setelah 3 kali pengulangan botol kultur dikeluarkan dari autoclave, simpan botol kultur di ruang inkubasi agar terhindar dari bakteri atau penyebab kontominasi yang lain.

Selain pembuatan media memasukkan agar-agar sebagai media dasar, pembuatan media juga termasuk di dalamnya adalah pembuatan larutan stok. Pembuatan larutan stok dengan bahan unsur hara makro dengan penambahan 10 kali dilarutkan di dalam 500 ml aquades. Unsur hara mikro dengan penambahan 100 kali dilarutan di dalam 500 ml aquades. Untuk pembuatan larutan stok C dan D dengan penambahan 10 kali dilarutkan di dalam 500 ml aquades. Sedangkan dalam pembuatan larutan stok E dengan penambahan 100 kali dilarutkan di dalam 500 ml aquades.

Medium dasar Murashige dan Skoog (MS) digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman herbaceus. Media ini mempunyai kansentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO₃^- dan NH₄⁺.

Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di dalam lemari es. Jika terjadi pengendapan maka sebelum larutan stok ini digunakan terlebih dahulu harus dipanaskan. Larutan stok yang sudah terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi. Oleh karena itu, sebaiknya bila larutan stok dibuat dalam jumlah yang tidak terlalu banyak maka faktor kebersihan tempat penyimpanan harus benar-benar dijaga.

Penentuan zat pengatur tumbuh yang akan digunakan memerlukan pengetahuan tentang cara menghitung dosisnya. Hal ini sangat penting karena apabila perhitungannya keliru dapat berakibat fatal bagi pertumbuhan jaringan. Zat pengatur tumbuh dengan dosis yang terlalu tinggi akan menghambat pertumbuhan kalus. Zat pengatur hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml.

Komposisi hormon dalam media sangat bervariasi tergantung dari spesies atau varietas tanaman yang dikembangbiakkan, eksplan yang dipakai, dan tujuan dari kultur. Oleh karena itu, penambahan zat pengatur tumbuh tidak dapat ditetapkan kadarnya.

V.         SIMPULAN DAN SARAN

A.      SIMPULAN

1.      Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di dalam lemari es. Faktor kebersihan tempat penyimpanan larutan stok harus benar-benar dijaga.

2.      Medium dasar Murashige dan Skoog (MS) digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman herbaceus. Media ini mempunyai kansentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO₃^- dan NH₄⁺.

3.      Sterilisasi medium sangat diperlukan karena menentukan tingkat keberhasilan pada saat penanaman eksplan. Untuk itu media yang digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu sebelum menanam eksplan.

B.       Saran

Sebaiknya sebelum melakukan pembuatan media, kita dalam keadaan steril. Baik dari pakaian kita, cuci tangan sebelum memegang alat yang akan digunakan dalam kultur jaringan, ataupun alat-alat yang akan dipergunakan dalam pembuatan media.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2010. Media Kultur Jaringan. www.fp.unud.ac.id. Diakses pada tanggal 24 Desember 2010.

Hendaryono, S dan Ari Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.

Pandhit. 2010. Tahapan Kultur Jaringan Tumbuhan. http://pandhit.files.wordpress.com. Diakses pada tanggal 24 Desember 2010.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara. Jakarta.

ACARA III

PENANAMAN EKSPLAN

a.         PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang

Pucuk-pucuk dan planlet in vitro yang diregenerasikan di dalam lingkungan dengan kelembapan tinggi dan bersifat heterotrof,harus berubah menjadi autotrof bila di pindahkan ke tanah atau lapangan.Proses pemindahan merupakan langkah akhir dari prosedur mikropropagasi dan di istilahkan sebagai tahap aklimatisasi.Menurut Yusnita (2003),aklimitasi adalah suatu upaya mengondisikan planlet atau tunas mikro hasil perbanyakanmelalui kultur in vitro ke lingkungan in vivo yang septik.Aklimitasi merupakan proses yang penting dalam rangkaian aplikasi teknik kultur jaringan untuk mendukung pengembangan pertanian.

Masa aklimatisasi merupakan masa yang kritis karena pucuk atau planlet yang di regenerasikan dari kultur in vitro menunjukkan beberapa sifat yang kurang menguntungkan,seperti lapisan lilin (kutikula) tidak berkembang dengan baik,kurangnya lignifikasi batang,jaringan pembuluh dari akar ke pucuk kurang berkembang,dan stomata seringkali tidak berfungsi (tidak menutup ketika penguapan tinggi).Keadaan itu menyebabkan pucuk-pucuk in vitro sangat peka terhadap transpirasi, serangan cendawan dan bakteri,cahaya dengan intensitas tinggi,dan suhu tinggi.Oleh karena itu,aklimitasipucuk-pucuk in vitro memerlukan penanganan khusus, bahkan di perlukan modifikasi terhadap kondisi lingkungan terutama dalam kaitannya dengan suhu,kelembapan,dan intensitas cahaya.Di samping itu,medium tumbuh pun memiliki peranan yang cukup penting,khususnya bila pucuk-pucuk mikro yang di aklimatisasikan belum membentuk sistem perakaran yang baik.

B.     TUJUAN

1.      Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan sub kultur

2.      Mengamati pertumbuhan eksplan

3.      Mencari faktor-faktor penyebab kegagalan di dalam kultur jaringan tanaman

II. TINJAUAN PUSTAKA

Kultur jaringan/Kultur In Vitro/Tissue Culture adalah suatu teknik untuk mengisolasi, sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik,sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali.

Menurut Gunawan (1988), arah pertumbuhan dan perkembangan atau regenerasi eksplan ditentukan oleh beberapa faktor yaitu: komposisi media serta jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh, bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan dan lingkungan tempat eksplan dikulturkan. Medium yang digunakan untuk membiakan potongan jaringan tersebut mengandung makanan berupa unsur – unsur hara makro dan mikro.

Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik yang bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung (promote), menghambat dan merubah proses fisiologi tumbuhan (Abidin, 1995).

Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan percobaan adalah biji dari tanaman jeruk. Alasan menggunakan biji tanaman jeruk adalah karena biji tanaman jeruk bersifat poliembrioni dimana dalam satu biji terdapat lebih dari satu embrio. Pierik (1981) menjelaskan bahwa poliembrioni pada spesies Citrus sering terjadi dalam satu biji terdapat embrio zigotik (muncul dari penyatuan satu sel telur dan satu sel gamet jantan) dan sejumlah embrio yang dibentuk secara vegetatif (sehingga dikatakan embrio adventif). Embrio adventif ini beregenerasi dari sel – sel dalam jaringan nusellus dan integumen. Menurut Bhojwani (1983), sel – sel somatik tersebut mengalami pembelahan dan membentuk embrio tambahan. George dan Sherrington (1984) menambahkan bahwa embrio tambahan tersebut akan menghasilkan anakan secara genetik identik dengan tanaman induknya. Jadi dengan penanaman dan pemeliharaan poliembrio secara kultur jaringan akan diperoleh tumbuhan yang sifatnya sama dengan induknya. Menurut Hendaryono (1994), selain memperoleh bibit yang seragam dan mirip dengan induknya melalui teknik kultur jaringan diperoleh tanaman yang bebas terhadap penyakit.

Penggunaan eksplan dari jaringan muda lebih sering berhasil karena sel-selnya aktif membelah, dinding sel tipis karena belum terjadi penebalan lignin dan selulose yang menyebabkan kekakuan pada sel. Gunawan (1988) menyatakan bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai eksplan adalah : pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil. Menurut Wattimena (1992) perbedaan dari bagian tanaman yang digunakan akan menghasilkan pola pertumbuhan yang berbeda. Eksplan tanaman yang masih muda menghasilkan tunas maupun akar adventif lebih cepat bila dibandingkan dengan bagian yang tua.

Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan (Mahmoudzadeh and Kruif ,1992).

Unsur makro dan mikro digunakan dalam bentuk senyawa garamnya. Sedangkan vitamin yang berfungsi untuk pertumbuhan umumnya dari kelompok vitamin B (B1, B6 dan B12). Pembentukan embrio somatik atau penggandaan tunas memerlukan zat pengatur tumbuh dari jenis sitokinin dan auksin. Medium yang digunakan dapat berupa cairan atau padatan dengan menambahkan agar. Media dalam botol yang berisi potongan jaringan kemudian ditempatkan dalam ruang dengan suhu dan kelembapan ruang nisbi yang terkontrol (berAC), dengan pencahayaan 12 jam per hari yang berasal dari lampu neon dengan intensitas cahaya antara 3.000 – 10.000 luks (Mahmoudzadeh and Kruif ,1992).

III.  PELAKSANAAN PRAKTIKUM

A.      BAHAN DAN ALAT

Bahan dan alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah :

1.      Bahan

a.       Bahan eksplan biji jeruk

b.      Media tumbuh

c.       Sterilan : alkohol, sublimat, clorox

d.      Aquades steril

2.      Alat

a.       Laminar Air Flow

b.      Erlenmeyer, petridish, scalpel, pinset, lampu

c.       Spirtus

d.      Hand sprayer

B.       PROSEDUR KERJA

1.      Sterilisasi Ruang dan Alat Penabur

Ruang kultur jaringan disterilkan dengan mengelap atau menyemprot dinding ruangan dengan alkoholn96% dan disinari dengan lampu ultra violet, minimal 1 malam. Alat penabur berupa Laminar Air Flow (LAF), semua dindingnya dilap dengan alkohol 96% dan disinari lampu ultra violet minimal 30 menit sebelum digunakan. Selama lampu ultra violet dinyalakan, blower tidak boleh dijalankan. Blower dijalankan apabila akan dilakukan penanaman dan lampu ultra violet dimatikan. Apabila LAF tidak dilengkapi dengan lampu UV, maka blower harus dijalankan terus menerus meskipun tidak digunakan untuk menanam agar ruang penabur tetap bersih dan steril.

2.      Penyiapan Eksplan

Eksplan adalah bahan tanaman yang akan dikulturkan, dapat berupa daun, tunas, pucuk, bunga, endosperm, buah muda, sel, protoplasma, dan yang lainnya.

Cara penyiapan eksplan biji jeruk :

a.       Biji jeruk dimasukkan kedalam botol steril dan disterilkan didalam LAF dengan alkohol 70% selama 1-2 menit sambil digojog, lalu alkohol dibuang

b.      Biji yang sudah disterilisasi dengan alkohol, disterilisasi dengan sublimat selama 0,5-1 menit sambil digojog, kemudian sublimat dibuang

c.       Biji dibilas dengan aquades steril hingga 3 kali sambil digojog

d.      Setelah bersih, biji diambil dengan pinset dan dikeringkan diatas kertas merang di dalam petridish steril untuk menghilangkan sisa air yang menempel pada biji

3.      Penanaman Eksplan

a.       Saat menanam eksplan harus dihindari jangan sampai tangan berlalu lalang diatas eksplan steril yang akan ditanam atau telah berada diatas medium yang terbuka

b.      Alat-alat dan lampu diletakkan disebelah kiri dan lampu spirtus jangan diletakkan dekat dengan alkohol

c.       Alat (pinset dan scalpel) sebelum digunakan diflamir terlebih dahulu dengan cara dicelupkan ke dalam alkohol 96% lalu dibakar dilampu bunsen sampai padam sendiri dan setelah dingin baru digunakan

d.      Media disiapkan, tutup botol (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati dan diletakkan disebalah kanan. Botol dipegang dengan tangan kiri dan dalam keadaan miring. Mulut botol diflamir diatas lampu spirtus. Ketika membakar mulut diputar dengan titik tengah lingkarannya sebagai poros agar seluruh mulut terkena api secara merata. Pemutaran dilakukan dengan hati-hati dan perlahan

e.       Eksplan diambil dengan menggunakan pinset steril yang sudah dingin, kemudian dimasukkan ke dalam medium untuk ditanam

f.       Sebelum botol ditutup, mulut botol dan bagian dalam tutupnya diflamir kembali

g.      Botol ditutup rapat diikat dengan karet gelang dan diberi label (jenis tanaman dan macam eksplan, tanggal penanaman dan nama praktikan)

h.      Botol kultur dikeluarkan dari LAF, botol bekas dan bahan yang tidak terpakai dikeluarkan dari LAF dan dibuang. LAF dibersihkan dengan cara menyemprot alkohol 96% dan dilap dengan menggunakan kain lap atau tissue steril atau kapas steril, lalu blower dan lampu TL dimatikan

i.        Botol-botol kultur disimpan di ruang inkubasi dan dilakukan pengamatan

4.      Pengamatan

Pengamatan meliputi :

a.       Saat eksplan tumbuh kalus, dihitung sejak penanaman hingga tumbuh kalus pertama

b.      Saat tumbuh tunas, dihitung sejak penanaman hingga tumbuh tunas pertama

c.       Jumlah tunas, dihitung hingga pengamatan terakhir

d.      Prosentase terkontaminasi, dihitung berapa prosen dari jumlah eksplan yang ditanam

IV.   HASIL DAN PEMBAHASAN

A.           Hasil Pengamatan

Tanggal	Botol I	Botol II	Botol III
4/12/2010	ü  Eksplan baik ü  Media tumbuh/agar-agar tetap bersih tidak ada kontaminasi	ü  Eksplan baik ü  Media tumbuh/agar-agar tetap bersih tidak ada kontaminasi	ü  Eksplan kontaminasi ü  Media ada kontaminasi berwarna putih seperti buih sabun
9/12/2010	ü  Eksplan baik ü  Eksplan hidup ü  Eksplan menampakkan adanya kalus	ü  Eksplan baik ü  Eksplan hidup	ü  Eksplan kontaminasi ü  Mediannya tertutup oleh kontaminasi dan eksplannya tak nampak lagi
13/12/ 2010	ü  Eksplan baik ü  Eksplan hidup ü  Kalus mulai muncul	ü  Eksplan baik dan hidup ü  Ada kalus yang nampak	ü  Eksplan tidak ada lagi karena tertutup oleh kontaminasi
15/12/2010	ü  Eksplan baik dan hidup ü  Kalus makin nampak jelas	ü  Eksplan baik dan hidup ü  Kalus nampak jelas	ü  Kontaminasi semakin menyebar, media telah tertutup oleh kontaminasi secara merata

Botol I	Botol II	Botol III

B.     Pembahasan

Faktor yang menentukan keberhasilan kultur jaringan tumbuhan adalah media dan zat pengatur tumbuh. Medium yang digunakan untuk membiakkan potongan jaringan tersebut mengandung makanan berupa unsur-unsur hara makro dan mikro. Disamping itu, ke dalam medium juga ditambahkan sumber karbon yang berasal dari sukrosa dan gula, vitamin dan zat pengatur tumbuh yang berfungsi untuk memacu pertumbuhan dan meningkatkan kemampuan sel untuk menjadi calon tanaman atau planlet (Dixon and Gonzales, 1994).

Unsur makro dan mikro digunakan dalam bentuk senyawa garamnya. Sedangkan vitamin yang berfungsi untuk pertumbuhan umumnya dari kelompok vitamin B (B1, B6 dan B12). Pembentukan embrio somatik atau penggandaan tunas memerlukan zat pengatur tumbuh dari jenis sitokinin dan auksin. Medium yang digunakan dapat berupa cairan atau padatan dengan menambahkan agar. Media dalam botol yang berisi potongan jaringan kemudian ditempatkan dalam ruang dengan suhu dan kelembapan ruang nisbi yang terkontrol (berAC), dengan pencahayaan 12 jam per hari yang berasal dari lampu neon dengan intensitas cahaya antara 3.000 – 10.000 luks (Willadsen, 1979).

Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyaratan untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan (Willadsen, 1979).

Keberhasilan dari kultur biji jeruk ini dalam pembentukan tunas juga dipengaruhi oleh sifatnya yang poliembrioni. Poli embrio pada biji jeruk ini berasal dari jaringan integument dan nusellus. Menurut Pierik (1987), jaringan nusellus dari Citrus bisa digambarkan seperti kumpulan jaringan juvenile yang memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Heddy (1986), menyatakan bahwa jaringan nusellus merupakan jaringan meristematik yang kaya akan auksin sehingga tidak memerlukan tambahan auksin dari luar. Umur eksplan berpengaruh terhadap kemampuan eksplan tersebut untuk tumbuh dan beregenerasi. Umumnya eksplan yang berasal dari tanaman yang masih muda (juvenil) lebih mudah tumbuh dan beregenerasi dibandingkan dengan jaringan yang telah terdiferensiasi lanjut.

LAF (Laminar Air Flow Cabinet) Alat yang letaknya diruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman.

Jalannya praktikum acara penenanaman eksplan yaitu :

a.       Sebelum memasuki ruang penanaman eksplan, kita diwajibkan dalam keadaan steril dari pakaian, tubuh, dan ruang yang akan digunakan tersebut

b.      Setelah steril semua, ketika akan memasuki ruangan harus cuci tangan terlebih dahulu, memakai masker, dan sarung tangan untuk memperkecil kemungkinan terjadinya kontaminasi eksplan yang akan ditanam

c.       Pada saat akan melakukan penanaman, terlebih dahulu tangan disemprot menggunakan alkohol

d.      Melakukan penanaman harus secara hati-hati jangan ceroboh

e.       Hal yang pertama kali dilakukan ialah memotong bahan eksplan yang akan ditumbuhkan. Sebelum melakukan pemotongan scalpel dan pinset harus dicelupkan ke alkohol terlebih dahulu, setelah itu di flamir kurang lebih 1 menit

f.       Apabila telah selesai digunakan scalpel dan pinset dimasukkan ke alkohol lagi

g.      Eksplan yang akan ditanam, di lakukan pembakaran tetapi jangan sampai gosong ataupun kelamaan dalam pembakaran agar eksplan tidak mati

h.      Setelah di lakukan flamir eksplan, eksplan kemudian di masukkan ke dalam botol kultur

i.        Kemudian ditutup dengan alumunium foil, tetapi sebelum ditutup dengan alumunium foil. Alumunium foil tersebut harus di flamir terlebih dahulu

j.        Eksplan disimpan di ruang kultur, yang ruangannya dilengkapi AC untuk mendapatkan suhu udara yang dikehendaki yaitu kurang lebih 1^oC

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan.  Tabung reaksi yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar. Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.  Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

Percobaan ini memakan waktu sekitar 2 minggu, dari 2 minggu tersebut dapat dilihat pertumbuhan dari eksplan. Dari tiga eksplan yang ditanam satu diantaranya mengalami kegagalan akibat adanya kontaminasi, namun dua eksplan yang lainnya masih baik. Pada botol ketiga hari pertama pengamatan sudah terlihat adanya kontaminan yang menyerang biji. Pada botol pertama dan kedua eksplan baik dan hidup. Eksplan yang ada di botol ketiga terdapat kontaminan, sehingga wujud fisik dari eksplan tersebut tidak dapat dilihat lagi tetapi di media tumbuhnya terdapat seperti kapas putih.

Terjadinya kontaminan tersebut diakibatkan oleh kurang hati-hatinya praktikan dalam bekerja pada ruang laminar, sehingga eksplan yang ditanam terkontaminasi. Kontaminan yang menyerang eksplan merupakan dari kingdom fungi karena dilihat dari wujud fisiknya yang berupa hifa-hifa atau seperti kapas.

Eksplan yang ada di botol kultur pertama dan kedua pada pengamatan ke tiga kalus sudah tampak, eksplan tersebut tumbuh dengan baik. Medianya pun tetap bersih. Beda dengan eksplan yang ada di botol kultur ketiga eksplannya sudah tidak namapk lagi karena tertutup kontaminasi dari jenis jamur.

Teknik kultur jaringan khususnya teknik sterilisasi eksplan  akan dapat berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplant sebagai bahan dasar untuk pembentukan kalus, pengunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Meskipun pada perinsipnya semua jenis sel dapat di tumbuhkan, tetapi sebiknya dipilih bagiantanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, misalnya: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya.

Pemotongan eksplan pada saat penanaman perlu di perhatikan, semakin kecil eksplan yang kita ambil maka akan semakin kecil pula kemungkinan terjadinya kontaminasi, namun demikian juga harus di ingat bahwa eksplan yang kecil lebih mudah rusak pada saat penanganan dan lebih rentan untuk gagal pada tahapan awal, untuk itu hindari penggunaan bahan tanaman yang akan dijadikan eksplan yang kontak langsung dengan tanah, dimana kemungkinan besar investasi penyakit atau penyebab terjadinya kontaminasi semakin besar.

V.      SIMPULAN DAN SARAN

A.       Simpulan

1.      Hasil dari pengamatan eksplan selama 2 minggu didapatkan hasil, pada botol kultur pertama dan kedua eksplan tumbuh dengan baik dan didapati kalus di dalamnya. Sedangkan pada botol kultur ketiga terdapat kontaminasi yang disebabkan oleh jamur.

2.      Faktor-faktor penyebab kegagalan dalam penanaman eksplan, anatara lain :

a.       Terjadinya kontaminan diakibatkan oleh kurang hati-hatinya praktikan dalam bekerja pada ruang laminar, sehingga eksplan yang ditanam terkontaminasi

b.      Kurang sterilnya alat-alat yang digunakan, ruang penanaman, ataupun ruang kultur

c.       Eksplan yang digunakan berasal dari induk yang tidak sehat dan baik

d.      Tempat tumbuh pada lingkungan yang tidak baik

B.     Saran

Pada praktikan disarankan agar lebih hati – hati dalam melakukan penanaman serta sesuai dengan petunujuk agar tidak terjadi kontaminan yang dapat mengakibatkan kegagalan dari praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Abidin, Z. 1985. Dasar-Dasar Tentang Zat Pengatur Tumbuh. Angkasa. Bandung.

Bhojwani, s.s and M. K. Razdan. 1983. Plant Tissue Cultur Theori and Practices. Elvisier Science Publishing Company Inc. New York.

Gunawan, I.W. 1988. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laborartorium Kultur Jaringan PAU. Bioteknologi. IPB. Bogor.

Hendaryono, D.P.S dan A. Wijayani. 1994. Teknik Kultur jaringan Perbanyakan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif. Kanisius. Yogyakarta.

Pierik, R.L.M. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martius Nijhoff Publisher. Dordrecht.

Wattimena, G.A. 1992. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman. Laboratorium Kultur Jaringan PAU Bioteknologi. IPB. Bogor.